生物样品培养

x.1 术语

以MCF-10A C和MDA-MB-231为例

PBS:

MDEM培养基:

细胞培养箱:

移液枪:

-20度冰箱和4度冰箱:

离心机:

细胞培养瓶:

通风橱:

显微镜:

记号笔:

x.2 细胞复苏

x.3 细胞传代

细胞传代的pipeline是: 准备试剂 -> 消化(含培养) -> 离心 -> 传代 -> 培养

1. 准备试剂

首先我们将需要用到的试剂如：细胞培养基，PBS，胰酶等从冰箱取出；使用酒精消毒后，放入通风橱中；

接着我们将需要用的设备，如50mL离心管，15mL离心管，细胞培养瓶酒精消毒后放入通风橱中；

将废液瓶，放废针管的快餐盒酒精消毒放入通风橱中；

2. 消化

我们取出上次传代的细胞培养瓶，使用 4x 显微镜观察细胞生长状态；

使用5mL移液枪将瓶中培养基吸入废液瓶中；

使用1mL PBS冲洗两次后吸出；

加入1mL 0.25%的胰酶使贴壁细胞消化；

将细胞培养基中胰酶摇匀后放入细胞培养箱中，计时，MDA-MB-231大概是5min消化完毕；

技巧：

• 每次与通风橱和细胞培养箱交互的时候都需要喷洒酒精
• 吸取细胞培养基时倾斜吸取一个角上的溶液
• 使用PBS吹打冲洗，像雨刷刮一样
• 移液枪扎枪管的时候，使劲往下戳两下防止没扎好

3. 离心

我们将培养瓶取出，放在显微镜下观察细胞是否消化完成，呈现悬浮状；晃动培养瓶使得细胞与壁完全脱离；

往细胞培养瓶中注入1mL细胞培养基，抑制胰酶消化；这个时候我们需要吹打和冲刷培养瓶的瓶壁使得细胞脱离瓶壁，完全在溶液中；

我们将2mL细胞培养液完全吸入15mL离心管中，在100g 22摄氏度 5min离心管中对称离心，使得细胞沉于底部；

技巧：

• 在显微镜观察下，贴壁的细胞是展开的，悬浮的细胞是球形的；

4. 传代

我们将传代后的离心管中上清液取出，只保留底部沉淀的细胞；

我们在新的细胞培养瓶上记录传代信息，传代的信息书写格式见技巧；我们往新的培养瓶中使用5mL离心管加入5mL培养基；（为什么是5mL，因为瓶中液面高度最好2mm）

使用1mL培养基加入离心管中，并吹打至完全溶解；将1mL溶液中吸出100uL加入到新的培养瓶中，吹打均匀，使得均匀铺满（由于这里是1mL中的100uL所以是1:10传代）；

技巧：

• 吸取离心管中溶液的方法是，倾斜离心管，将离心管中的上清液尽量吸出；

• 传代的信息书写格式是：

231 (细胞名)			p13 (传代数)

1:10 (这次传代和上次传代的比例, 3天长满)

5.2 (今天实验的日期)

5. 培养

将细胞培养瓶放入细胞培养箱中培养；

x.4 细胞计数与细胞接种

pipeline: 消化(含培养) -> 离心 -> 计数 -> 接种

书接上一次x.3中细胞传代，从3. 离心后开始。

1. 计数

我们将沉淀后的15mL离心管中的细胞沉淀物中加入1mL的细胞培养基，从中取了100uL进行了1:10传代；

我们拿一新的1.5mL离心管，往其中注入1mL细胞培养基，从剩余900uL细胞溶液的15mL离心管中吸出200uL或者300uL？？？加入到1.5mL离心管中，吹打；

我们吸出10uL细胞溶液到细胞计数板上，上部和下部都吸入，在4x或10x 显微镜下观察并计数；最终计数总数/8 万个细胞/mL；

2. 接种

准备若干共聚焦培养皿，在皿中各加入1mL细胞培养液，根据需要的细胞总数增加定量的溶液；

将培养皿放入细胞培养箱中；

细节：

1. 在配比适当总数的细胞溶液时候，不要一次性加太少

x.5 细胞染色

细胞染色的pipeline是: 消化(含培养) -> 离心 -> 染色(含培养) -> 离心 -> 计数 -> 接种 -> 培养

书接上一次x.3中细胞传代，从3. 离心后开始。

3. 染色

我们将沉淀后的15mL离心管中的细胞沉淀物中加入1mL的细胞培养基，从中取了100uL进行了1:10传代；

我们拿一新的1.5mL离心管，往其中注入200uL细胞溶液，再加入0.2uL染色剂；

将离心管放入细胞培养箱中30min；

取出后离心；

将顶层溶液吸去，加入1mL培养基，吹打；

计数；

按照需要的细胞数量接种；