单细胞做转移癌怎么筛选靶点和验证，学习一下这篇10分文章

今天给大家分享一篇JCR一区，单细胞的文章：Single-cell transcriptomics reveal metastatic CLDN4+ cancer cells underlying the recurrence of malignant pleural effusion in patients with advanced non-small-cell lung cancer

• 标题：单细胞转录组学揭示了在晚期非小细胞肺癌患者中，转移性CLDN4+癌细胞是恶性胸腔积液反复发作的根本原因
• 期刊名称：Clinical and Translational Medicine
• 影响因子：10.6
• JCR分区：Q1
• 中科院分区：医学1区
• 小类：医学：研究与实验2区 肿瘤学2区

摘要

背景：
由非小细胞肺癌（NSCLC）引起的反复发作性恶性胸腔积液（MPE）往往对传统治疗方法难以应对，并且缺乏预测性标志物。反复发作性MPE的细胞或基因特征仍然大部分不确定。

方法：
招募了16例有胸腔积液的NSCLC患者，并根据原发性肿瘤进行相应的治疗。治疗3-6周后确定是否有反复发作的MPE。通过计算机断层扫描（CT）和细胞病理学验证了MPE的状态，并收集了基线胸腔液进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。样本随后进行整合和分析。通过生物信息学算法推断细胞间的通讯和轨迹。进行比较分析，并通过定量聚合酶链反应（qPCR）在作者中心的更大MPE队列（n = 64）中进一步验证结果。

结果：
scRNA-seq显示，共有33,590个细胞被注释为7种主要细胞类型，并被进一步精确地划分为14个细胞簇。细胞簇C1被分类为上皮细胞黏附分子（EpCAM）阳性的转移性癌细胞，并与紧密连接和黏附连接的激活相关，在反复发作的MPE组中显著富集，其中确定了克劳丁-4（CLDN4）。C1的子细胞簇C3在反复发作的MPE中富集，并展示了一种阿米巴型细胞迁移的表型，同时还显示了CLDN4的显著更高表达。与驱动基因状态无关，CLDN4的表达还与E74类ETS转录因子3（ELF3）、EpCAM和肿瘤相关钙信号转导物2（TACSTD2）的表达呈正相关。CLDN4还与缺氧诱导因子1亚基α（HIF1A）和血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达相关，并且细胞簇C1是VEGFA信号的细胞间通讯的主要中介者。在广泛的MPE队列中，观察到在被诊断为反复发作性MPE的患者的胸腔积液中CLDN4的表达明显增加，与非反复发作组相比，这也与趋向更差的总生存率（OS）相关。

结论：
CLDN4可被认为是晚期NSCLC患者中反复发作性MPE的预测性标志物。需要在样本规模更大的队列中进一步验证其临床价值，并对其生物功能进行深入机制研究。

结果

• PCR引物设计

图1 C1簇中具有最高百分比的癌细胞被捕获在反复发作的MPE中。

• （A）样本收集和数据获取的示意图。
• （B-i）来自16个样本的所有细胞的t-SNE降维图。 （ii）细胞中的细胞类型注释。 （iii）在C0-C13簇中的离散细胞类型注释。
• （C-i）非反复发作和反复发作细胞簇中的细胞百分比。 （ii）非反复发作和反复发作细胞簇中的总细胞百分比。
• （D）跨四组样本和细胞簇的离散细胞百分比。
• （E）癌细胞、DCs和T细胞中细胞百分比的组间比较。
• （F）在（1）巨噬细胞、（2）单核细胞和（3）成纤维细胞中的细胞百分比簇内比较。

图2 分子鉴定和功能注释MPE中癌细胞基因签名的研究。

• （A）热图展示跨14种细胞类型表达的保守标记物。
• （B）癌细胞C1、C5、C8和C12的PCA降维图。
• （C）C1、C5、C8和C12簇中重叠的基因签名。
• （D）在细胞簇之间不同表达的基因的GSEA富集分析。
• （E）3个基因集中的重叠基因。
• （F）在所有14个簇中CLDN4、CLDN1、CLDN7和MET的表达。

图3 CLDN4被确认为反复发作MPE的生物标志物，与癌细胞增殖相关，并受到转录因子ELF3的调控。

• （A）t-SNE图展示了从14个细胞簇中重新聚类的C1簇的C0-C5簇。
• （B）在重新聚类的C1簇中非反复发作和反复发作的细胞百分比。
• （C）CLDN4在6个簇中的表达。
• （D）基于CRISPR-KO的数据分析显示CRISPR敲除筛选在6个不同细胞系中的细胞增殖状态。
• （E）C3簇中与CLDN4相关的基因。
• （F）在C3簇中反复发作与非反复发作之间不同表达基因的GO富集分析。
• （G）工作模型展示了基于转录因子调控网络分析的筛选调控性转录因子的流程。
• （H-i）基于转录因子调控网络分析的调控性转录因子网络。（ii）6个簇中ELF3的表达。
• （I-i）在上述C3簇中CLDN4和ELF3基因表达的相关性分析。（ii）通过不同表达基因分析推断的ELF3敲除和野生型组之间的不同表达基因。

图4 CLDN4作为反复发作MPE的生物标志物与驱动基因突变状态无关。

• （A）重新聚类的野生型样本的t-SNE图，按（i）样本类型和（ii）细胞类型注释进行分组。
• （B）在重新聚类的C1簇中非反复发作和反复发作组的细胞百分比。
• （C）展示在重新聚类的13个细胞簇中表达的保守标记物的热图。
• （D）13个细胞簇中CLDN4和ELF3的表达。
• （E）与野生型细胞子集和C1簇中CLDN4相关的基因。
• （F）总细胞簇中基于细胞百分比加权的CLDN4相关基因的表达。
• （G-i,ii）VEGFA和HIF1A与CLDN4呈正相关的表达。

图5 细胞间相互作用分析表明MIF信号和VEGFA信号在反复发作MPE中是关键影响因素。

• （A）反复发作样本（i,ii）和非反复发作样本（iii,iv）中的细胞通讯模式。
• （B）反复发作样本中的MIF信号。（i）所有细胞簇中MIF信号的相互作用模式。（ii）所有细胞簇中MIF、CD44和CD74的表达。（iii）信号方向和显著性的总结。
• （C）反复发作样本中的VEGFA信号。（i）所有细胞簇中VEGFA信号的相互作用模式。（ii）所有细胞簇中VEGFA和KDR的表达。（iii）信号方向和显著性的总结。
• （D）通过轨迹推断解读分化特征。（i）C1和C3单核细胞的细胞轨迹。（ii）单核细胞分化过程中的基因签名。
• （E）C2簇中反复发作与非反复发作之间差异表达基因的GO富集分析。
• （F）C3簇中反复发作与非反复发作之间差异表达基因的GO富集分析。

图6 CLDN4作为预测反复发作MPE的诊断性生物标志物的临床验证。

• (A) 在验证队列中，晚期非小细胞肺癌患者中非反复发作或当前MPE的（i）CLDN4、（ii）ELF3、（iii）EPCAM和（iv）TACSTD2的表达水平。
• (B-i) CLDN4低或高表达的晚期非小细胞肺癌患者的总生存率和（ii）无进展生存率。
• © 晚期非小细胞肺癌患者中得分<0.8或≥0.8的总生存率，这些得分来自包含CLDN4、ELF3、治疗策略和疾病病理学的Cox回归模型。
• (D) 验证队列中晚期非小细胞肺癌患者的基线特征。

小结

• 主要数据及方法：